|  print

Detection of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water samples with a Becton Dickinson FACSort flow cytometer
[ Detectie van Cryptosporidium oocysten en Giardia cysten in water met een Becton Dickinson FACSort flow cytometer ]
 
Schets FM, Medema GJ, Boschman GD

24 p in English   1995
RIVM Rapport 289202004
download pdf (1031Kb)  

Toon Nederlands

English Abstract
Current detection techniques for Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water samples combine filtration of large volumes of water, concentration by centrifugation and flotation and immunofluorescense microscopy. The techniques are extremely labour-intensive and inefficient. The various steps in the sample processing procedures cause large losses of (oo)cysts resulting in an average overall recovery of about 3% in surface water samples. Microscopic interpretation of concentrates is time consuming and difficult due to the presence of debris. We used fluorescence activated cell-sorting with a flow cytometer prior to fluorescence microscopy in order to improve our standard method. We therefore incorporated the FACSort flow cytometer prior to epifluorescence microscopy in our current detection method to purify Cryptosporidium and Giardia (oo)cysts in concentrated river water, sewage water and secondary effluent samples. The (oo)cysts were stained with FITC-conjugated monoclonal antibodies and sorted by the FACSort on the basis of fluorescence and forward scatter characteristics on a 13 mm polycarbonate membrane filter. 28 environmental samples (including 10 seeded samples) were examined with both our standard method and the method with the FACSort flow cytometer. The FACSort flow cytometer proved to be user-friendly and easy to operate and it improved the performance of the standard method. With FACSort 96% of the samples were positive for Giardia, the geometric mean was 8.6 cysts per liter. The standard method detected Giardia cysts in 86% of the samples with a geometric meam of 4.1 cysts per liter. In 22/25 samples that were examined with both methods FACSort detected 14 (range 1.2-84) times as many cysts per liter as the standard method. Differences between FACSort and standard are significant (P<0.05). FACSort detected Cryptosporidium in 74% of the samples, while the standard method detected oocysts in 64% of the samples. Geometric means were 0.95 and 0.38 oocysts per liter respectively. FACSort found 17 (range 1.1-91) times as many oocysts per liter in 15/27 samples that were examined with both methods ; differences are, however, not significant. FACSort sorted (oo)cysts onto membrane filters and microscopic preparations obtained were very clean and easy to interpret, thus giving more reliable counts. When sorting was performed onto 13 mm diameter membrane filters microscopy time could be reduced with approx. 70%. The overall recovery of both methods is relatively low. FACSort recovered 5.9% of the Cryptosporidium oocysts and 17.1% of the Giardia cysts and the standard method recovered 2.9% of the oocysts and 15.6% of the cysts. The low overall recovery is not due to the performance of the FACSort flow cytometer, for this instrument recovered 95% of oocysts present in the suspension. But FACSort as well as the standard method use the same sample processing procedure which includes various steps that cause large losses of (oo)cysts. Recommendations are made to improve the discrimination of (oo)cysts from the debris with other monoclonal antibodies or fluorochromes, in order to overcome the need for microscopic confirmation. The recovery of the entire sample processing procedure may be improved when flow cytometry is coupled with calcium carbonate flocculation. Sorted samples containing (oo)cysts and relatively low levels of debris may be suitable for the application of techniques predicting viability which is a key characteristic in determining the impact of environmental (oo)cysts on human health. Pure suspensions of sorted environmental (oo)cysts may also be used in species-specific PCR assays.

 

RIVM - Bilthoven - the Netherlands - www.rivm.nl

Display English

Rapport in het kort
De huidige methode die in de Verenigde Staten, Groot- Brittannie en Nederland wordt gebruikt voor de detectie van Cryptosporidium en Giardia in water bestaat uit een combinatie van filtratie, concentratie door centrifugeren en flotatie en immuunfluorescentie microscopie. De methode is zeer arbeidsintensief en inefficient. Tijdens het opwerken van de monsters gaan veel (oo)cysten verloren; dit resulteert in een gemiddelde overall recovery van ongeveer 3% in monsters oppervlaktewater. Interpretatie van de microscopische preparaten is zeer tijdrovend en bovendien wordt hinder ondervonden van het in de preparaten aanwezige debris. In dit onderzoek werd de huidige methode verbeterd door gebruik te maken van fluorescence activated cell-sorting met een flow-cytometer. Hiertoe werd de FACSort flow cytometer ingepast in de huidige methode om de (oo)cysten van Cryptosporidium en Giardia uit concentraten van rivierwater, rioolwater en secundair effluent te zuiveren. De (oo)cysten werden gekleurd met FITC-gelabelde monoclonale antilichamen en op basis van hun fluorescentie en forward-scatter eigenschappen gesorteerd op een 13 mm polycarbonaat membraanfilter. 28 milieu monsters (inclusief 10 kunstmatig besmette monsters) werden onderzocht met zowel de standaard methode als de methode met de FACSort. De FACSort bleek zeer gebruikersvriendelijk en gemakkelijk te bedienen en verbeterde de prestaties van de standaard methode. Met de FACSort was 96% van de monsters positief voor Giardia (geometrisch gemiddelde 8,6 cysten/l), met de standaard methode was dit 86% (geom. gem. 4,1 cysten/l). In 22/25 monsters die met beide methoden werden onderzocht detecteerde FACSort 14 ( range 1,2-84) maal zo veel cysten als de standaard methode. Verschillen tussen de beide methoden zijn significant (P<0,05). FACSort detecteerde Cryptosporidium in 74% van de monsters (geom. gem. 0,95 oocysten/l), terwijl de standaard methode dat in 64% van de monsters deed (geom. gem. 0,38 oocysten/l). FACSort vond 17 (range 1,1-91) maal zo veel oocysten in 15/27 monsters die met beide methoden werden onderzocht ; de verschillen tussen de beide methoden zijn echter niet significant. Met de FACSort werden (oo)cysten op membraanfilters gesorteerd ; de verkregen preparaten waren erg schoon en makkelijk te beoordelen, waardoor de tellingen betrouwbaarder werden. Bij sorteren op membraanfilters met een diameter van 13 mm kon de tijd nodig voor microscopische beoordeling met ca. 70% gereduceerd worden. De overall recovery van beide methoden is relatief laag. Met FACSort werd voor Giardia een recovery van 17,1% behaald, voor Cryptosporidium bedroeg de recovery 5,9%. De standaard methode vond 15,6% van de cysten en 2,9% van oocysten terug. De lage overall recovery is niet te wijten aan de FACSort ; deze vindt 95% van de oocysten in een suspensie terug. De monster opwerk procedure die voor beide methoden gelijk is kent echter een aantal stappen die een aanzienlijk verlies van (oo)cysten veroorzaken. Er worden een aantal aanbevelingen gedaan om het onderscheidend vermogen van de FACSort te verbeteren door andere monoclonale antilichamen of fluorochromen te gebruiken, om de microscopische bevestiging te laten vervallen. De recovery van de totale opwerkings procedure kan verhoogd worden als flow cytometrie gekoppeld wordt met flocculatie met calciumcarbonaat. Gesorteerde monsters die naast (oo)cysten weinig debris bevatten zijn mogelijk ook geschikt voor het gebruik van technieken die de levensvatbaarheid van (oo)cysten vaststellen. Levensvatbaarheid is het belangrijkste criterium bij het bepalen van de gevolgen van (oo)cysten uit het milieu voor de volksgezondheid.

 

RIVM - Bilthoven - Nederland - www.rivm.nl
Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu RIVM
( 1995-03-31 )