Ondanks de verwachte classificering van TiO2 als ‘verdacht kankerverwekkend bij inademing voor de mens’ is er nog onduidelijkheid of TiO2 kankerverwekkend is en via welk mechanisme dat zou worden veroorzaakt. Om meer duidelijkheid over de genotoxiciteit te krijgen hebben Franse onderzoekers na strenge selectie 36 in-vitrostudies geëvalueerd. Deze evaluatie geeft geen eenduidig beeld, maar helpt wel om meer lijn te krijgen in de harmonisatie van de testprotocollen. Het RIVM Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu onderschrijft de aanbevelingen van de auteurs om verschillende vormen van nanodeeltjes op dezelfde manier te testen.

In juni 2017 heeft de 'Risk Assessment Committee' (RACRisk Assessment Committee) van het Europees Agentschap voor Chemische Stoffen (ECHA European Chemicals Agency ) geadviseerd om alle vormen van titaniumdioxide (TiO2) te classificeren als ‘ verdacht kankerverwekkend bij inademing voor de mens’ (categorie 2) (zie Signaleringsbrief 3, 2017). Dit is gebaseerd op data vanuit enkele dierstudies. Epidemiologisch onderzoek heeft geen verband aangetoond tussen TiO2-blootstelling en longkanker bij de mens. Ook het biologische mechanisme waardoor TiO2-nanodeeltjes tumoren veroorzaken in proefdieren is niet duidelijk.

Er zijn twee mogelijke mechanismen voor genotoxiciteit van TiO2-nanodeeltjes, namelijk door direct op het DNA deoxyribonucleic acid  aan te grijpen (een direct genotoxisch mechanisme) of door indirecte effecten te veroorzaken, zoals bijvoorbeeld het vrijmaken van reactieve zuurstofradicalen. Deze radicalen beschadigen vervolgens het DNA (indirect genotoxisch mechanisme). Deze mechanismen kunnen over het algemeen makkelijker in celsystemen (in vitro) uitgezocht worden.

Franse onderzoekers van ANSES hebben in-vitrostudies volgens strenge kwaliteitscriteria geselecteerd en beoordeeld. Zo moest voldoende beschrijving gegeven zijn van de fysisch-chemische eigenschappen (op zijn minst de vorm, afmeting en coating van de TiO2-nanodeeltjes). Ook moest het onderzoek uitgevoerd zijn volgens OESO Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling  [2]-richtlijnen of (voor de comet[3]) middels een veelgebruikt internationaal protocol. Verder moest er gekeken zijn naar opname van nanodeeltjes in de cel, effecten van positieve en negatieve controles en moesten meerdere metingen een uitkomst onderbouwen.

Van de meer dan 100 in-vitrostudies naar genotoxiciteit van TiO2, bleven er 36 over. In deze 36 studies zijn 88 verschillende testen uitgevoerd, waaronder de micronucleustest[4], de chromosomale afwijkingentest[5], en de comet-test. De uitkomsten gaven geen eenduidig beeld over de mogelijke genotoxiciteit van TiO2-nanodeeltjes: 60% gaf een positief resultaat, de rest was negatief. De inconsistentie werd verklaard uit de variatie in zowel de intrinsieke fysisch-chemische eigenschappen van de geteste nanodeeltjes (bijvoorbeeld kristalvorm en grootte) als de manier van testen. Ook bij het volgen van een internationaal protocol, bleven er variaties in bv. het gebruikte kweekmedium en de aanwezigheid van licht, welke de chemische reactiviteit van de TiO2-nanodeeltjes kunnen beïnvloeden. De invloed van de fysisch-chemische parameters (zoals afmeting, kristalvorm en coating) op de testen kon niet worden vastgesteld, doordat dit niet systematisch is onderzocht en de testcondities verschilden. Als aanbeveling om dit in de toekomst te verbeteren geven de auteurs aan dat het essentieel is om verschillende vormen van TiO2 op dezelfde manier te testen.

De meeste in-vitrostudies lijken erop te wijzen dat DNA-schade ontstaat door een indirect mechanisme via reactieve zuurstofradicalen. Enkele studies waarbij TiO2 in de celkern werd vastgesteld suggereren juist een direct effect van TiO2-nanodeeltjes op het DNA. De auteurs geven aan dat, gedreven vanuit het publiek belang, er nog meer studies naar de genotoxiciteit van TiO2-nanodeeltjes zullen worden gedaan. Ze hopen dat op basis van hun aanbevelingen kwaliteit boven kwantiteit zal gaan.

RIVM Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu/KIR kennis- en informatiepunt risico’s van nanotechnologie -overweging: Er kan geen harde uitspraak over de genotoxiciteit van TiO2 gedaan worden. Toch is het onderzoek van ANSES French agency for Food, Environmental and Occupational Health Safety een degelijke en belangrijke poging om hierover duidelijkheid te scheppen. Een stof die genotoxisch is, is in principe ook kankerverwekkend. Of het ook tot kanker leidt is een kans die afhangt van de blootstelling en het kankerverwekkende vermogen van een stof.

Heel waardevol is dat de auteurs een lijst testcondities bespreken, die de uitkomsten kunnen beïnvloeden en waar dus in het vervolg goed op gelet dient te worden. Het RIVM onderschrijft de aanbevelingen van de auteurs om verschillende vormen van nanodeeltjes op dezelfde manier te testen.

Daarvoor is het belangrijk om testprotocollen en richtlijnen met name te harmoniseren op de condities die specifiek van belang zijn voor nanodeeltjes, zoals het kweekmedium, aanwezigheid van eiwitten (vanwege de eiwitcorona die gevormd wordt rondom het deeltje) en het uitvoeren van de test in het donker. Met name anatase TiO2-nanodeeltjes kunnen activeren door uv ultraviolette ultraviolet -A-licht wat leidt tot fotokatalytische reacties waarbij reactieve zuurstofradicalen ontstaan.

Het RIVM organiseerde in juni 2018 een workshop met internationale experts om meer consensus te krijgen over uitvoering van de verschillende toxiciteitstesten waaronder die voor genotoxiciteit. Dit was een gezamenlijk initiatief vanuit de EU European Union   projecten PATROLS Physiologically Anchored Tools for Realistic Nanomaterial Hazard Assessment  en GRACIOUS in samenwerking met het Nanosafety Cluster. Tijdens de workshop werd onder andere het resultaat gepresenteerd van een ILSI-HESI werkgroep, die gekeken heeft welke genotoxiciteitstesten überhaupt geschikt zijn om nanodeeltjes mee te testen, en of daar nog aanvullende vereisten bij van toepassing zijn. De aanbevolen set van testen voor nanodeeltjes is een in-vitro-HPRT– of TK-genmutatietest in zoogdiercellen en daarbij ofwel een in-vitro-micronucleustest, ofwel een in-vitro-chromosomale afwijkingentest. Optioneel zijn de in-vitro-comet-test en enkele in-vivotesten. De drie testen in de studie van ANSES vallen dus in deze aanbevolen set. Dat maakt duidelijk dat zelfs met de aanbevolen set nog inconsistente uitkomsten verkregen kunnen worden. Genmutatietesten zijn sowieso nog nodig, omdat deze ontbreken in de ANSES-analyse.

In de workshop werd ook aangegeven dat de huidige genotoxiciteitstesten wellicht nog niet geschikt zijn om een indirect genotoxisch mechanisme van TiO2-nanodeeltjes op te pikken. Het is daarom verstandig om – voordat er nieuwe genotoxiciteitstesten uitgevoerd worden – eerst hierover meer duidelijkheid te krijgen en er mogelijk een aangepaste test voor te vormen. Op basis van de huidige in-vivo– en in-vitrodata lijkt het daarom vooralsnog niet mogelijk een harde uitspraak te doen over de genotoxiciteit van (nanodeeltjes van) TiO2. Dit is een ongewenste situatie gezien de veelvuldige toepassing van het nanomateriaal in verven, huishoudelijke producten, cosmetica en als voedingsadditief (E171). Er is verbetering van de testmethoden en protocollen nodig, waarna nieuwe testen beter uitsluitsel zouden kunnen geven.

 


[1]   ANSES is het Franse Agentschap voor Veiligheid en Gezondheid van Voedsel, Milieu en Arbeidsomstandigheden (Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail).

[2]   OESO is de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling.

[3]   De comet-test is een eenvoudige en gevoelige techniek om breuken in DNA-strengen op te sporen in individuele eukaryotische cellen. Het patroon wat tijdens de test ontstaat onder de microscoop lijkt op een komeet (in het Engels ‘comet’).

[4]   Een micronucleus is een kleine kern die ontstaat als (een deel van) een chromosoom niet goed in een cel terecht komt tijdens celdeling. Met deze test kan chromosomale schade aangetoond worden. Deze test is makkelijker uit te voeren dan de chromosomale afwijkingentest.

[5]   Met de chromosomale afwijkingentest kunnen structurele afwijkingen in het chromosoom worden opgespoord. Een chromosoom bestaat uit strak opgerold DNA.